오크라톡신 A(오크라톡신 A)는 다양한 아스페르길루스(오크라톡신)와 페니실리움(페니실리움 베루코스포라)에 의해 생산되며, 시트리닌과 옥살산도 생산됩니다. . 오크라톡신은 열대 및 온대 지역, 귀리, 보리, 밀 및 옥수수 작물에서 흔히 발견됩니다. 이 곰팡이는 최대 10ppm의 오크라톡신 A를 생산할 수 있습니다. 이렇게 높은 수준의 오크라톡신은 드물며, 0.2ppm과 같은 낮은 수준의 독소라도 돼지 생산에 유해한 영향을 미칠 수 있습니다(Krogh, 1991).

오크라톡신으로 오염된 사료를 먹는 단일위 동물은 조직, 장기, 지방, 근육 조직 및 혈액이 독소로 오염될 수 있습니다. 돼지가 장기간 동안 오크라톡신으로 오염된 사료를 섭취할 경우, 마이코톡신은 돼지의 식용 조직 대부분을 오염시켜 신장 손상을 일으키고 돼지고기 도체 등급을 낮출 수 있습니다. 급성 오크라톡신 독성(5ppm 이상의 식이 독소 수준)은 신장병증(신부전), 장염, 지방간, 림프절 괴사, 면역억제를 특징으로 하며 기타 다양한 병리학적 증상을 동반합니다. 급성 오크라톡신 독성은 급성 신부전으로 인해 동물이 사망할 수 있습니다. 오크라톡신이 동물의 식용 근육 조직에 축적되어 인체 건강에 문제를 일으킬 수 있다는 점을 고려하여 최근 연구자들은 오크라톡신의 발암성에 대한 연구에 집중하고 있습니다. 실제로 덴마크 돼지 산업에서는 잠재적으로 유해한 독소 잔류물이 돼지고기 제품에 존재하는지 여부를 나타내는 지표로 신장 오크라톡신 수준을 사용합니다. 임상 징후와 부검을 통해 오크라톡신 독성이 드러날 수 있으며, 이는 사료 내 마이코톡신을 모니터링하거나 도축장에서 신장의 독소 수준을 테스트하여 확인할 수도 있습니다.

혈청 내 오크라톡신의 긴 반감기(72~120시간)로 인해 돼지는 오크라톡신 오염에 매우 민감합니다. 독일, 노르웨이, 폴란드, 스웨덴, 구 유고슬라비아를 포함한 캐나다와 유럽 연합의 연구자들은 최근 돼지 혈액에서 천연 오염물질인 오크라톡신 검출에 대한 조사를 실시했습니다. 동시에 미국, 오스트리아, 벨기에, 덴마크, 핀란드, 독일, 폴란드, 스위스, 영국, 구유고슬라비아 등지에서 조사한 결과 돼지 신장에서도 오크라톡신이 나타났다.

동물성 제품의 오크라톡신 잔류물은 먹이 사슬을 통해 소비자에게 전달될 수 있으며 일부 국가의 정부는 돼지고기 제품의 안전에 대한 소비자의 우려를 없애기 위해 엄격한 규제 조치를 취했습니다. 예를 들어, 유럽에서는 1997년 모든 식품의 오크라톡신 최대 허용 수준을 5ppb로 설정했습니다. 독일은 이 기준을 3ppb로 더욱 엄격하게 설정했습니다. 덴마크에서는 돼지 혈액 내 오크라톡신 수치가 25μg/mL에 도달하면 돼지 도체 전체가 오염된 것으로 간주해 돼지고기를 섭취해서는 안 된다.

임상적 영향

오크라톡신 중독의 주요 증상은 성장 지연과 사료 효율성 감소입니다. 간에 손상이 있지만 주로 신장에 손상이 있어 신장 간질 섬유증을 유발합니다. 수분 섭취 증가(극심한 갈증)로 인해 배뇨 증가(다뇨증)는 오크라톡신 중독의 특징입니다. 경직과 관련된 신경주위 부종은 성장하는 어린 돼지에서 발생합니다. 위궤양도 흔한 증상이다. 멧돼지의 정자의 질이 저하되고 수정율도 떨어지게 되어 결국 전체적인 생식능력이 떨어지게 됩니다.

중독 환자의 임상적 발현

생산능력 감소(사료섭취량, 성장률, 사료효율)

신장이 창백해지고 비대해짐 = 신세뇨관변성, 신장 간질성 섬유증

신장 기능 손상 = 고알부민혈증, 질소혈증

신부전 = 사망

물 섭취 증가(극심한 갈증)), 배뇨 증가(다뇨증)

세포 면역 억제 = 감염에 대한 민감성 대폭 증가

멧돼지 정자의 질 저하 = 수정율 감소 = 생식 능력 감소

자돈의 부종 = 등이 뻣뻣해지고 걸음이 불안정함

위궤양 1 주제 내용 및 적용 범위

이 표준은 곡물과 대두의 오크라톡신 A 수준을 지정합니다.

이 표준은 밀, 옥수수, 대두의 오크라톡신 A 측정에 적용됩니다.

TLC 플레이트에서 검출 가능한 오크라톡신 A의 최소량은 4ng였습니다. 이 방법의 최소 검출량은 10μg/kg이다.

2원리

시료 중의 오크라톡신 A를 추출하기 위해 클로로포름-0.1mol/L 인산 또는 석유에테르-메탄올/물을 사용하고, 시료추출액은 액체를 통해 분배된다. 이후 365nm 자외선 하에서 나타나는 황록색 형광을 기준으로 박층크로마토그래피판의 표준물질과 비교하여 함량을 측정하였다.

3 시약

별도의 규정이 없는 한, 다음 시약은 분석적으로 순수한 시약이며, 물은 증류수 또는 동등한 순도의 물입니다.

⒊1 석유에테르(60~90℃ 또는 30~60℃).

⒊메탄올 2개.

⒊3 클로로포름.

⒊4 톨루엔.

⒊5 에틸아세테이트.

⒊6 포름산.

⒊7 빙초산.

⒊8 이더.

⒊9벤젠-아세토니트릴(98:2).

⒊100.1mol/L 인산[c(H3PO4)=0.1mol/L]: 인산(85) 11.5g을 달아 물을 넣어 1000mL로 한다.

⒊112mol/L 염산용액[c(HCL)=2mol/L] : 염산 20mL를 달아 물을 넣어 120mL로 묽힌다.

⒊124 염화나트륨 용액.

⒊130.1mol/L 중탄산나트륨용액[c(NaHCO3)=0.1mol/L] : 중탄산나트륨 8.4g을 달아 적당량의 물을 넣어 녹인 후 물을 넣어 1000mL로 한다.

⒊14 실리카겔 G: 박층 크로마토그래피용.

⒊15 오크라톡신 A(이하 OA) 표준용액 : 벤젠-빙초산(99:1)을 사용하여 40 μg/mL 오크라톡신 A 원액을 제조하고 자외선으로 농도를 측정한다. 분광 광도계. 농도는 GB5009.22 "식품 중 아플라톡신 B1 측정 방법"의 2.14조에 따라 측정됩니다(오크라톡신 A의 최대 흡수 피크 파장은 333nm, 분자량은 403, 몰 흡광 계수 값은 5550입니다). . 원액을 정밀하게 뽑아 벤젠으로 희석하여 1ml당 오크라톡신A가 0.5μg이 되도록 한다. 오크라톡신A 표준용액은 빛을 피하여 냉장고에 보관한다.

4가지 도구

모든 유리 도구는 묽은 염산에 담근 후 수돗물과 증류수로 헹구어야 합니다.

⒋1 소형 분쇄기.

⒋2 전기 발진기.

⒋3 유리판: 5cm×20cm.

⒋4 얇은 층 어플리케이터.

⒋5 확장 슬롯: 내부 길이 25cm, 너비 6cm, 높이 4cm.

⒋6 UV 램프: 365nm.

⒋7 미세주사기: 10μL, 50μL.

⒋8 10mL, 0.2mL 꼬리 튜브가 있는 소형 농축병.

5가지 분석 단계

⒌1 추출

⒌1.1 방법 A

분쇄하여 여과기를 통과한 시료 20g을 계량합니다. 20 메쉬 체를 200 mL 삼각플라스크에 넣고 클로로포름 100 mL 및 0.1 mol/L 인산 10 mL를 첨가하고 30분간 흔들어 준 후 신속정성여과지로 여과하고 여액 20 mL를 여과기에 넣는다. 250 mL 분액깔대기, 50 mL 첨가 0.1 mol/L 중탄산나트륨용액을 2분간 흔든 후 방치하여 분리한 후 클로로포름층을 다른 100 mL 분액깔대기에 넣는다(소량의 유화층 또는 클로로포름층이 완전히 유화되면 분액깔대기에 넣을 수 있다), 0.1mol/L 중탄산나트륨용액 50mL를 넣고 클로로포름층 추출을 반복하여 정치하여 분리하고 클로로포름층을 버린다. 여전히 유화된 경우 폐기하십시오. 결과에 영향을 미치지 않습니다.)

1차 분별깔대기에 중탄산나트륨수층을 합치고 2mol/L 염산용액 약 5.5mL를 넣어 pH를 2~3으로 맞춘 후(pH종이로 시험) 클로로포름 25mL를 넣어 2분간 흔들어 섞는다. 방치한 후 클로로포름층을 물 100mL가 들어있는 다른 250mL 분별깔때기에 넣고 산성수층을 클로로포름 10mL와 함께 흔들어 추출한 후 정치시켰다. 분리 깔때기. 75ml 증발 접시에 분리 깔대기의 하단을 닦아 건조시키십시오. 증발접시의 잔류물을 클로로포름 약 8mL를 일괄적으로 녹이고 꼬리관이 달린 10mL 농축병에 옮겨 담아 80℃ 수욕상에 놓고 증기로 가열하고 질소(N2)를 불어 넣어 농축한다. 건조하고 벤젠 0.2 mL를 가한다. - 잔류물을 아세토니트릴(98:2)에 녹이고 잘 흔들어 섞은 후 박층 크로마토그래피에 사용한다.

⒌1.2 방법 B

파쇄하여 20메쉬 체를 통과한 샘플 20g의 무게를 측정하고 200mL 마개 삼각 플라스크에 석유 에테르 30mL와 100mL를 첨가합니다. 메탄올-물 ( 55:45), 누출을 방지하기 위해 코르크 위에 물 층을 두십시오. 30분간 흔들어 준 후 급속정성여과지로 분별깔대기에 여과하고, 하부 메탄올수층을 분리한 후 여액 20mL를 취하여 100mL 분액깔대기에 넣어 시험한다. pH는 일반적으로 5~6입니다. 클로로포름 25 mL를 넣어 2 분간 흔들어 섞은 후 축성 방치한 후 클로로포름층을 다른 분액깔대기에 넣고 반복하여 클로로포름 10 mL를 넣어 흔들어 메탄올-물층을 추출한다(클로로포름으로 흔들어 추출). 유화하는 경우 층화를 촉진하기 위해 메탄올을 한 방울씩 첨가할 수 있음) 동일한 분별 깔대기에 클로로포름층을 합치고 염화나트륨용액 50~100mL4를 첨가한다(첨가량은 품종에 따라 다르며 대두는 100mL 첨가), 밀은 약 50mL 첨가 및 옥수수), 흔들어서 배치한다(대두 시료 추출물인 경우에는 분액 깔때기를 반복적으로 가볍게 뒤집어 유화층이 점차 상승하도록 해야 한다. 유화가 심한 경우에는 메탄올을 조금 첨가한다), 클로로포름층이 나올 때까지 기다린 후 정화 후 분액깔때기 하단을 흡수성 솜으로 건조시킨 후 클로로포름층을 75mL 증발접시에 담는다(대두시료인 경우에는 클로로포름 10mL를 넣어 흔들어 섞은 후 같은 증발접시에서 클로로포름층을 합친다). 증발 접시를 스팀 욕조에 올려서 환기시키고 건조시킵니다.

다음 작업은 "증발접시의 잔여물을 클로로포름 약 8mL를 일괄적으로 녹이는 것"부터 시작하여 방법 A에 따라 작업한다.

⒌2 정량

⒌2.1 박층판의 준비

실리카겔 G 4g에 물 10mL 정도를 넣고 절구로 갈아서 페이스트가 됩니다. 바로 어플리케이터에 부어서 5cm×20cm, 두께 0.3mm의 박판 3장을 만들고, 공기 중에서 건조시킨 후 105~110℃에서 1시간 동안 활성화시킨 후 꺼내서 데시케이터에 보관하세요.

⒌2.2 두 개의 얇은 판을 준비하고 얇은 판의 하단에서 2.5cm 떨어진 기준선에 마이크로 주사기로 두 점을 떨어 뜨립니다. 왼쪽에서 1.7cm 떨어진 곳에 OA를 추가합니다. 플레이트 가장자리에 표준액(농도 0.5 μg/mL) 8 μL를 넣고 플레이트 왼쪽 가장자리에서 2.5 cm 떨어진 곳에 검액 25 μL를 떨어뜨린 다음 OA 표준액(농도 0.5 μg) 8 μL를 첨가합니다. /mL)을 두 번째 플레이트의 샘플 용액 지점에 표시합니다. 얼룩이 졌을 때는 한 방울씩 떨어뜨리면서 헤어드라이어로 말려야 하며, 뜨거운 공기와 찬 공기를 번갈아가며 사용해야 합니다.

⒌2.3 현상

⒌2.3.1 현상제

현상제: 에테르 또는 에테르-메탄올-물(94:5:1).

세로방향 확산제:

a. 톨루엔-에틸 아세테이트-포름산-물(6:3:1.2:0.06) 또는 톨루엔-에틸 아세테이트-포름산(6:3) :1.4) b. 벤젠-빙초산(9:1).

⒌2.3.2 팽창

측면 팽창 : 팽창탱크에 횡팽창제 10mL를 붓고 먼저 박층판을 원점에서 2~3cm 세로로 팽창시킨 후 꺼낸다. 1~2분 후 박층판의 긴 면을 같은 현상탱크의 용매에 기준점에 가깝게 놓고 수평으로 펴서 도포한다. 수평 살포제가 부족할 경우 적당량을 첨가한다. 플레이트 끝까지 펴 바른 후 1분간 기다린 후, 통풍된 용매를 꺼내어 2~3분간 증발시킵니다.

세로팽창 : 다른 팽창탱크에 세로팽창제 10mL를 붓고, 횡팽창된 박층판을 앞쪽 가장자리가 원점에서 13~15cm 멀어질 때까지 수직으로 팽창시킨다. 꺼내서 판 표면에 신맛이 나지 않을 때까지(약 5~10분) 통풍시켜주세요.

⒌2.4 관찰 및 평가

관찰을 위해 박층 크로마토그래피 플레이트를 365nm 파장의 자외선 램프 아래에 놓습니다.

a. UV 조명 하에서 두 개의 플레이트를 서로 비교하면 두 번째 플레이트의 샘플 액체 지점이 OA 표준점의 해당 위치에서 가장 낮은 검출량을 갖는 경우입니다. 두 번째 플레이트의 경우 첫 번째 플레이트의 동일한 위치에서 검출량이 가장 낮습니다. 형광 반점이 나타나지 않으면 샘플의 OA 함량은 이 측정 방법의 최소 검출량인 10μg/kg 미만입니다.

b. 첫 번째 플레이트 시료 액체 반점이 두 번째 플레이트 시료 액체 반점과 동일한 위치에 형광 반점이 나타나는 경우 두 번째 플레이트 시료 액체의 형광 반점이 적하된 표준 형광 반점과 겹치는지 확인합니다. 그런 다음 다음과 같은 정량적, 확증적 테스트를 수행합니다.

⒌2.5 희석 정량

검체 용액과 표준 OA 스팟의 OA의 형광 강도를 비교하고 희석 인자를 추정합니다.

박막판을 두 방향으로 팽창시킨 후 양성 샘플의 OA 함량이 높을 때 OA의 형광 반점이 옆으로 늘어나 반점이 편평해지거나 두 개의 황록색으로 나누어집니다. 형광 반점. 이는 수평팽창 과정에서 원점의 ​​OA 양이 실리카겔의 흡착능력을 초과하기 때문이다. OA의 황록색 형광을 측정할 수 있습니다. 표준 형광 강도와 비교하여 줄여야 하는 마이크로리터 수 또는 필요한 희석 인자를 추정합니다. 희석 후 함량을 측정할 때 시료 용액 점의 왼쪽 기준선에 2개의 표준점을 떨어뜨릴 수 있습니다. OA의 양은 4ng 또는 8ng일 수 있습니다. 대략적인 2개의 표준 OA 형광점과 시료 용액의 형광 강도를 비교하십시오. 부량.

⒌2.6 확인 시험

크로마토그래피 플레이트에 중탄산나트륨 에탄올 용액(중탄산나트륨 6.0g을 물 100mL에 녹인 후 에탄올 20mL 첨가)을 분무하고 실온에서 건조시킨 후 관찰한다. 장파장 자외선 하에서는 OA 형광점이 황록색에서 파란색으로 변해야 하며, 분무 전 상황과 일치하지 않는 경우에는 형광 강도가 증가합니다. 스프레이하기 전에 추정한 것입니다.

6 계산

샘플 내 오크라톡신 A의 함량은 다음 공식에 따라 계산할 수 있습니다.

V11000

x=A×━━×D×━━━

V2m

여기서 x──황토는 샘플 아스퍼질러스 독소 A의 함량, μg/kg;

A──박막 플레이트에서 측정한 샘플 액체 점의 OA 양, μg;

D── 샘플 액체의 총량 희석 계수;

V1─-벤젠-아세토니트릴 혼합물의 부피, mL;

V2─가장 낮은 샘플 용액의 부피 나타나는 형광점, mL;

m─-벤젠-아세토니트릴이 용해되었을 때 시료의 등가 질량, g.

7 정밀도

이 방법은 5명의 공동 연구자에 의해 검증되었으며, OA 첨가량은 10, 50, 100μg/kg, 각 수준마다 n=2일 때 이 방법은 회수율은 다음과 같이 표현된다. 옥수수의 값은 각각 88±9.68; 103±41.2입니다. [위 데이터는 (X±SD)]